Metoda FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) používá optický mikroskop ke snímání doby života fluorescence. Patří mezi techniky fluorescenční mikroskopie, která se vyznačuje tím, že k vytvoření kontrastu jednotlivých mikroskopických snímků využívá fluorescenci. Výstupem je tzv. FLIM mapa, která udává prostorovou distribuci doby života fluorescence pro zvolenou oblast vzorku. Sestavu pro FLIM lze realizovat kombinací optického mikroskopu s TCSPC luminiscenčním spektrometrem.
Standardní konfigurace sestavy fluorimetr plus mikroskop
Fluorescenční širokopásmové zobrazování
V této konfiguraci se k excitaci vzorku využívá širokospektrální Xe lampa, která je součástí luminiscenčního spektrometru. K výběru požadované vlnové délky slouží excitační monochromátor, jehož výstup je přiveden k mikroskopu pomocí kapalinového světlovodu či optického vlákna. Budící svazek je uvnitř mikroskopu odražen od dichroického zrcadla a nasměrován do objektivu. K záznamu luminiscenčního obrazu slouží citlivá kamera.
- širokopásmový fluorescenční snímek BPAE (bovine pulmonary artery endothelial) buněk
Detekce luminiscenčních spekter
V tomto uspořádání je využita excitační i emisní větev spektrofluorimetru. Kapalinové světlovody (optická vlákna) zajišťují přenos budícího signálu z fluorimetru do mikroskopu a luminiscenčního signálu z mikroskopu do fluorimetru.
Detekce doby života fluorescence/fosforescence
Pro měření doby života luminiscence je do mikroskopu integrována pulzní laserová dioda, která slouží jako zdroj excitace. Nasměrování laserového svazku na požadované místo na vzorku se provádí pomocí kamery a posuvného stolku. Luminiscenční signál je pomocí kapalinového světlovodu (případně optického vlákna) doveden do emisního ramene TCSPC spektrometru.
- doznívání fluorescence DAPI po navázání na DNA, doba života určena pomocí TCSPC techniky
FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)
Je-li součástí mikroskopu počítačem řízený mikroskopický XYZ stolek, pak lze celou sestavu v konfiguraci pro detekci doby života luminiscence použít pro FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). U této metody fluorescenčního zobrazování je kontrast výsledného obrázku založen na době života jednotlivých fluoroforů. Výsledná mapa udává prostorovou distribuci doby života fluorescence pro zvolenou oblast vzorku. K buzení luminiscence se kromě pulzních laserových diod stále častěji používají superkontinuální lasery, které generují pulzní (pikosekundové) širokospektrální záření. Uživatel má tak mnohem větší flexibilitu ve výběru excitační vlnové délky.
