Kvantitativní 3D prostorová analýza tkání kostní dřeně

Vizualizace buněk a buněčných struktur v trojrozměrné podobě sebou přináší větší nároky na zpracování obrazu než v případě klasické 2D mikroskopie. Konfokální mikroskopy umožňují nedestruktivním způsobem zobrazovat a měřit objekty ve velmi vysokém rozlišení a díky snímání desítek až stovek optických řezů je možné rekonstruovat pomocí vhodného analytického programu výsledný obraz jedné oblasti ve 3D rozměrech. Analytický software Imaris k rekonstrukci a vizualizaci 3D obrazu umožňuje sledovat prostorové uspořádání buněčných struktur, jejich vzájemné interakce, globální distribuci a mnoho dalších vlastností.

3D snímek myší kostní dřeně získaný složením desítek až stovek optických řezů nasnímaných konfokálním mikroskopem. Červený kanál zobrazuje vaskulárně specifický marker endomucin a zelený signál odpovídá CXCL12-GFP, který označuje fibroblastickou mesenchymální retikulární buňku bohatou na CXCL12 (CARcs) ze stromální populace. S laskavým svolením laboratoře Nombela-Arrieta, Fakultní nemocnice a Univerzity v Curychu.

Podle autorů studie lze získat informace o rozdělení buněčných interakcí v tkáních kostní dřeně pouze detailní vizualizací daných typů buněk a jejich kvantifikací pomocí prostorové analýzy. Na základě tohoto předpokladu bylo v kostní dřeni analyzováno metodou konfokální mikroskopie pozoruhodně velké množství složek stromálních buněk - sinusoidálních endotelových buněk a mesenchymálních retikulárních buněk bohatých na CXCL12 chemokiny (CARcs), oproti původním odhadům stanovených pomocí konvenční metody průtokové cytometrie. Navíc bylo zjištěno, že oba typy buněk se shlukují do topologicky složitých sítí, navzájem se spojují pomocí ECM (pozn. extracelulární matrix) a prostupují do tkáně kostní dřeně. Prostorová charakterizace stromálních buněk a dalších krevních struktur je rozhodující pro definování mikroprostředí, ve kterém jsou krevní buňky udržovány (niky).

Využití softwaru Imaris k segmentaci sinusoidálních mikrocév (pozn. žilní ekvivalent kostní dřeně) a jejich zobrazení ve formě povrchů (znázorněno červeně). CARcs znázorněné pomocí modulu Imaris Spots a reprezentované jako zelené body, prázdný prostor mezi objekty transformován na sinusoidy a zobrazen ve stupních šedi. S laskavým svolením laboratoře Nombela-Arrieta, Fakultní nemocnice a Univerzity v Curychu.

Autoři studie použili několik Imaris modulů k analýze počtu, distribuce a prostorového rozložení CARcs a sinusoidálních endotelových buněk odebraných z kostní dřeně mladých a starých myší. Funkce Imaris Spots byla použita k určení souřadnic CARcs, funkce Imaris Surfaces k segmentaci endotelových stěn sinusoidálních mikrocév. Segmentace lumenu (pozn. vnitřní část; průsvit) každé mikrocévy představuje hlavní výzvu při zpracování obrazu, jelikož nevyzařuje žádný specifický fluorescenční signál. Díky programovacímu rozhraní Imarisu dokázali vědci vytvořit nástroje pro zpracování obrazu umožňující úplnou vaskulární segmentaci a rekonstrukci na základě použití dříve vytvořených povrchů v Imarisu. Také se jim podařilo sestrojit analytický nástroj, který využívá body (buňky) a povrchy (cévy nebo prostorově protažené struktury) ke studiu distribuce a potenciálních interakcí.

Vědci plánují rozšíření možností vizualizace a zpracování obrazu kombinací Imarisu s jejich analytickým softwarem za účelem rychlé, spolehlivé a plně automatické identifikace buněčných typů. Cílem je vytvoření podrobné a integrované mapy buněčné anatomie ve zdravé a nemocné kostní dřeni.

Funkce Spots a Surfaces jsou součástí analytického software Imaris, který umožňuje provádět komplexní analýzu obrazových dat získaných z konfokální nebo light sheet mikroskopie a nabízí širokou škálu funkcí pro detekci a modelování biologických struktur s možností kontroly výsledků v každém bodě pracovního postupu. Imaris obsahuje mnoho speciálních modulů přizpůsobených konkrétním aplikacím.

Klíčové vlastnosti Imaris:

vhodný pro detekci bodových objektů: buněk, bakterií, částic, proteinových klastrů, vezikul, buněčných jader, centrosomů
výpočty a 3D vizualizace bodových nebo vezikulárních struktur
lze vytvářet snímky s desítkami až stovkami tisíc objektů
výpočet XYZ souřadnic každého objektu, lze měřit relativní vzdálenost mezi objekty
možnost 3D trackingu
rychlá analýza objemných dat (Fast Spots Technology - Imaris 9.2)
vhodný k přesné vizualizaci a měření: buněk, buněčných organel a jader, biofilmů, tkání, orgánů, embryí, organoidů
počítačově generované zobrazení vybrané oblasti vzorku (ROI)
vizualizace a výpočet datových souborů až do velikosti stovek GB
sledování objektů v čase (změna polohy, tvaru a intenzity)
měření plochy, objemu, intenzity, elipticity a sféricity objektů