Mikroskopie živých buněk (live cell imaging) je velmi oblíbenou metodou v oblasti buněčné biologie. Získání správných a kvalitních informací podléhá několika specifickým faktorům, které mohou experimenty s živými buňkami výrazně ovlivnit. Pro live cell imaging doporučujeme konfokální mikroskop na bázi rotujícího kotouče – SDCM (spinning disc confocal microscope), anebo widefield fluorescenční mikroskop se softwarem pro dekonvoluci.
Při pozorování živých buněk (live cell imaging) je třeba klást veliký důraz na redukci foto-toxických účinků světla (bleaching). Hustota výkonu osvětlení na rovině vzorku, kompatibilní se životem zkoumaných buněk, se pohybuje v rozmezí od mW/cm2 (widefield fluorescenční mikroskopy) do W/cm2 (konfokální mikroskopy SDCM – spinning disc confocal microscopes). Při vysoké hustotě výkonu osvětlení dochází k intenzivnímu bleachingu fluoroforů, což vytváří volné radikály a další reakční produkty, které ničí molekuly v okolí a mění prostředí vně a uvnitř buněk.
Buněčné kultury a tkáně je nutné udržovat ve fyziologických podmínkách po celou dobu experimentu. Faktory jako teplota, vlhkost, složení média a pH jsou velmi důležité pro získání smysluplných informací o zkoumaných procesech. V závislosti na původu kultivovaných buněk je třeba nastavit výše zmíněné faktory na konkrétní hodnoty a tyto hodnoty udržovat stabilní.
Mitochondrie v gliomových buňkách. iXon Ultra, 60x, NA: 1.49. Nasnímáno bylo celkem 6 478 1Mpx snímků! Voxel 0.201*0.201*0.293 um, X/Y:1024*1024 pixelů, Z:41, T:79, 2 kanály. Data byla nasnímání během krátkého (13 min) time-lapse experimentu při demonstraci systému Andor Dragonfly. Vzorky poskytla Dr. Veronika Huntošová z UPJS/CIB, Košice, Slovensko.
Esenciální vybavení pro live cell imaging mikroskop je uvedeno v tabulce:
| Vybavení | Přínos | Důvod | Výrobce |
|---|---|---|---|
| Konfokální mikroskop (SDCM) |
Nízký bleaching Vysoká rychlost snímání |
Disk se sadou pinhole zajišťuje konfokalitu Osvětlení celého zorného pole najednou Využití kamer pro detekci emisního signálu |
Andor |
| Dekonvoluce |
3D rekonstrukce snímků z widefield fluorescenčního mikroskopu Vyšší rozlišení |
Algoritmy pro odstranění signálu z roviny mimo zaostření Reorganizace signálu podle parametrů použitého mikroskopu |
Bitplane |
| Kamery |
Vysoká citlivost Vysoká rychlost Vysoké rozlišení |
Sofistikovaná architektura senzoru (sCMOS/EMCCD) Rychlé vyčítání signálu |
Andor |
| Inkubátor | Kontrola teploty, vlhkosti, pH | Izolace vzorku od okolního prostředí a přesná regulace podmínek při průběhu experimentu | Okolab |
| Motorizovaná stage |
Vysoké rozlišení Opakovatelnost |
Precizní kompontenty Piezo motory pro maximální rozlišení |
PI |
| Vizualizace a analýza |
3D vizualizace Analýza získaných informací Porovnání výsledků |
Kolokalizace (2D/3D colocalization) Trasování (2D/3D tracking) Zisk statistických údajů Tvorba grafů |
Bitplane |
Konfokální mikroskop Andor Dragonfly splňuje všechny předpoklady pro zobrazování živých buněk (live cell imaging):
Rychlost snímání
- 400 snímků za sekundu (512 × 512 pixelů)
- Minimální expozice – 2,5 ms
Citlivost
- 90% kvantová účinnost u kamer iXon (EMCCD)
- 82% kvantová účinnost u kamer Zyla (sCMOS)
Kontrola prostředí
- Inkubátory od předních světových výrobců (Okolab)
Mikroskop
- Precizní XY a Z piezo motorizovaná stage
- Hardware autofocus
- Specializované objektivy
Další
- Active blanking – propojení mezi světelným zdrojem a kamerami
- Filtry – kompatibilní s požadovanými vlnovými délkami v excitační a emisní cestě
