Na rozdíl od snímání klasickou metodou fluorescenční mikroskopie v režimu widefield je u konfokální mikroskopie potlačen signál ze vzorku, který pochází z oblasti mimo ohniskovou rovinu. Díky tomu lze pozorovat preparáty o větší tloušťce při zachování kontrastu a vysokého poměru signálu vůči šumu. Na konfokálním mikroskopu vybaveném detektorem nebo kamerou a pracovní stanicí s příslušným software (Imaris) je pak uživatel schopný digitálně rekonstruovat trojrozměrný model celého preparátu (3D vizualizace). Existují dva hlavní přístupy:
- CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) – Konfokální laserová skenovací mikroskopie
- SDCM (Spinning Disc Confocal Microscopy) – Konfokální mikroskopie na bázi rotujícího kotouče
Obrázek 1:. Schématické znázornění konvenčních mikroskopických technik (Andor, 2016)
Nevýhodou laserové skenovací konfokální mikroskopie je soustředění velice intenzivního laserového paprsku na každý zobrazovaný bod (pixel). Tím je preparát dlouhodobě vystaven toxickým účinkům světla. Navíc je nutné, aby světlo z laserového paprsku dopadlo na všechny snímané body postupně, z čehož vyplývá výrazné omezení rychlosti snímání, především při vysokém rozlišení (např. 2048 x 2048 pixelů). K potlačení signálu z oblasti mimo ohniskovou rovinu dochází díky použití tzv. “pinhole” o variabilní velikosti, která je umístěna před detektorem.
Obrázek 2.: Widefield (vlevo),konfokální mikroskopie (vpravo). Jedna optická rovina (60× 1.2 NA). Obrázky pořízené v režimu widefield obsahují signál z oblasti mimo ohniskovou rovinu. Konfokální mikroskop na bázi rotujícího disku poskytuje ostrý obraz z jedné ohniskové roviny s více detaily a také s vyšším kontrastem a dynamickým rozsahem. Dragonfly, Andor (Andor, 2016).
Konfokální mikroskopie na bázi rotujícího Petráňova/Nipkowova disku (spinning disc) dosahuje velmi rychlého snímání obrazu o vysokém rozlišení. Excitační optická dráha vede skrz tzv. rotující disk obsahující vysoké množství “pinholes”, které zajišťují konfokalitu získaného obrazu (Obrázek 3.). Již při pootočení disku o několik stupňů dosáhneme pokrytí celého zorného pole (rychlosti se pohybují kolem 6000 otáček za minutu - Dragonfly). Další výhodou konfokální mikroskopie na bázi rotujícího disku je použití citlivých a velice rychlých kamer s vysokým dynamickým rozsahem pro detekci obrazu (Zyla/iXon).
Klíčové výhody spinning discu
- Vysoká rychlost snímání (stovky až tisíce snímků za sekundu)
- Vysoká citlivost (kvantová účinnost kamer až 95 %)
- Nízká foto-toxicita
- Redukovaný foto-bleaching
Zdroj zprávy: „Spinning Disk Confocal – A Technical Overview...“ Accessed November 25, 2016 www.andor.com/learning-academy/spinning-disk-confocal-a-technical-overview
